本发明提供了一种测定土壤微生物趋化性芯片的制备方法，属于生物化学与环境技术领域，包括：将含有微腔室、通道和混合区的芯片进行打印，得到光刻掩膜；将光刻胶置于硅片中心后依次进行匀胶、烘干，将光刻掩膜与匀好胶的硅片的外边框对准后进行紫外曝光，得到曝光硅片，将所述曝光硅片烘干后用有机试剂PEGEMEA显影，再烘干坚模，得到阳模；将PDMS预聚体和固化剂混合后，置于阳模上，静置后进行固化，得到PDMS印章；将PDMS印章进行表面亲水化改性处理，得到处理印章，将趋化剂加入到处理印章的微腔室后，与载玻片贴合，得到测定土壤微生物趋化性芯片。采用本发明制备得到的芯片能够原位、定量和可视化测定土壤微生物趋化性。