本发明公开了一种苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物及生物测算方法，其步骤是：1)采集土壤样品提取磷脂脂肪酸；2)气相色谱？质谱联用仪分析磷脂脂肪酸组成；3)对各磷脂脂肪酸进行归类并找出苜蓿根瘤菌的磷脂脂肪酸生物标记物；4)以此磷脂脂肪酸标记物含量计算苜蓿根瘤菌生物量。方法是经过对苜蓿根瘤菌纯培养菌株的磷脂脂肪酸组成分析，筛选其特异性磷脂脂肪酸并定为其专一性生物标记物，再通过土壤取样分析确证的专一性磷脂脂肪酸生物标记物。本发明是针对苜蓿根瘤菌筛选到的专一性磷脂脂肪酸生物标记物，可以用于测算土壤中苜蓿根瘤菌的生物量。